Вивчення кортикофільних міксоміцетів під час наукового стажування в Німеччині

Опубліковано: 2020-08-13

Дослідницьке стажування на базі Грайфсвальдського університету ім. Е. М. Арндта (м. Грайфсвальд, Німеччина) проходила з грудня 2019 р. по травень 2020 р. м. н. с. лабораторії захисту лісу А. В. Кочергіна.

Виконана в ході стажування серія експериментів мала на меті встановлення видового складу, кількісної структури та генетичного різноманіття угруповань кортикофільних міксоміцетів південного сходу України. Серед усіх екологічних груп міксоміцетів (це лісові мешканці, схожі на гриби), кортикофільні – одна з найскладніших для досліджень. За рідкісним винятком, це дуже дрібні істоти з коротким життєвим циклом, який не перевищує 10 діб. Значна частина кортикофільних міксоміцетів – дуже непоказні і схожі один на одного, тому проблема їхнього розрізнення залишається актуальною. Дуже часто представників декількох схожих видів кортикофільних міксоміцетів вважають за один вид, а розподіл їх за родами здійснюють за штучно відібраними ознаками. Водночас сучасна систематика не визнає жодної довільності: живі організми є результатом еволюції, тож їхня класифікація має відображати хід еволюційних подій. А щоб ці події реконструювати, потрібен аналіз ДНК. Власне, перший, і часто найдовший крок у подібних дослідженнях – виділення й очищення ДНК, зчитування нуклеотидних послідовностей певного маркерного гену та порівняння структури цього гену у різних особин.

У попередні роки для вилучення ДНК зі спор міксоміцетів українські науковці використовували різноманітні набори для спін-фільтрації, зокрема Invisorb Spin Plant minikit. Метод доволі дешевий, але дуже довгий, зі складним багатоетапним очищенням екстракту. Під час стажування було застосовано метод direct-PCR (прямого ПЛР), який німецькі колеги жартома називають «cheap and dirty», тобто дешевий і брудний. Неофіційна назва пов’язана з тим, що після гомогенізації спорового матеріалу і лізису мембран, ДНК-екстракт не очищують від молекул білків і ліпідів, а піддають ПЛР прямо в присутності залишків клітинних структур. Оскільки останні можуть містити інгібітори ДНК-полімераз, метод краще працює з дуже невеликою кількістю спор (50–100). Але в цьому й полягає найважливіша перевага методу, адже для багатьох видів міксоміцетів, зокрема кортикофільних, саме такою є максимально доступна кількість спор. Саме завдяки цьому методу було одержано нуклеотидні послідовності гену 18S рРНК таких дрібних представників міксоміцетів як Comatricha ellae,Cribraria violacea,  Enerthenema papillatum та Perichaena  chrysosperma.

Відбір проб спор міксоміцетів для екстракції ДНК

Протягом стажування також розпочато експеримент з одержання екстрактів тотальної ДНК з недозрілих зразків і плазмодіїв, що формуються у вологих камерах. Метод полягає в тому, що матеріал стерильним пінцетом переносять у ємність зі стабілізаційним розчином, після чого одержаний екстракт безпосередньо використовують як ДНК-матрицю у ПЛР зі специфічними праймерами.

Ця методика дуже перспективна, адже може дозволити встановлювати видову приналежність тих видів, які не здатні утворювати в умовах вологої камери повноцінних спороношень.

Ще одне цікаве дослідження, проведене в рамках стажування в Німеччині, пов’язане з молекулярним баркодингом так званих нівальних міксоміцетів – екологічної групи, що відрізняється схильністю до утворення спороношень навесні, відразу після танення снігу. В результаті дослідження матеріалу, зібраного під час експедиції до Карпатського національного парку навесні 2019 р., було визнано в понад 80 зразках ген 18S рРНК міксоміцетів. Деякі з виявлених генотипів виявилися раніше незареєстрованими в міжнародній базі даних GenBank і потенційно новими для науки (хоча цей висновок ще має бути ретельно перевірений).

А. В. Кочергіна під час роботи з цифровим мікроскопом Keyence VHX-6000

Стажування не обмежувалося лабораторною роботою. У лютому–березні 2020 р. відбулася тритижнева експедиція до Коста-Ріки, де було зібрано вражаючий польовий матеріал.

Там же пройшов Х Міжнародний конгрес із систематики та екології міксоміцетів (10th International Congress on Systematics and Ecology of Myxomycetes, ICSEM 10). Ця подія відбувається кожні три роки і щоразу збирає найавторитетніших фахівців-міксоміцетологів. У конгресі взяли участь представники США, Японії, Іспанії, Мексики, Франції, Австралії, Філіппін, Бельгії, Індії, Колумбії та інших країн. Доповіді охоплювали проблеми моніторингу та оцінювання біорізноманіття, систематики, морфології та екології міксоміцетів, глобального метабаркодингу, шляхам практичного використання цих організмів і навіть їхньому інтелекту.

Роль міксоміцетів у лісових екосистемах ще дуже слабко вивчена. Можна припустити, що деякі види дадуть змогу рано виявляти певні патологічні процеси в лісових насадженнях.

А. В. Кочергіна,

в.о. м. н. с. лабораторії захисту лісу

Фотографії надані авторкою

Титульне фото: Мікрофотографія кортикофільного міксоміцета Cribraria violacea